6月10日，艾偉拓邀請到多位業(yè)內專家，圍繞“核酸脂質遞送系統(tǒng)穩(wěn)定性”這一主題，從核酸/脂質遞送系統(tǒng)穩(wěn)定性困境與潛在對策、mRNA關鍵質量屬性、脂質體及LNP凍干工藝開發(fā)、脂質遞送系統(tǒng)中保護劑應用等不同方面展開介紹與討論。

各位專家分享的干貨得到了觀眾的積極反饋，提出了很多有深度的問題。艾偉拓產品團隊對問題及答復進行了收集整理，以供各位醫(yī)藥制劑行業(yè)的朋友參考。如果您有其他疑問或想法希望進一步討論，歡迎加入我們的專業(yè)討論群，加群方式詳見本文末尾。

此外，對于未能參與本次線上論壇的朋友也請不用著急，艾偉拓已與多位業(yè)內專家建立起長期合作關系，會持續(xù)推出不同主題的線上/線下產業(yè)學術論壇/課程/城市會等活動，始終致力于助力我國制劑行業(yè)發(fā)展。具體活動信息，請關注艾偉拓公司公眾號！

以下為線上論壇部分問題及專家答復整理，分為遞送系統(tǒng)相關、保護劑相關及凍干工藝相關三部分：

一、脂質遞送系統(tǒng)相關問題及答復：

1、載有mRNA的LNP的物理穩(wěn)定性如何？已上市疫苗是否也有這方面的問題才選用冷凍儲存方式？

通過檢測內容物滲漏等指標，LNP物理穩(wěn)定性整體上是比較穩(wěn)定的。已上市疫苗選擇冷凍儲存的主要原因不是物理穩(wěn)定性問題。

2、魚精蛋白法可以用于沉淀此類脂質載體嗎？

理論上或許可行，但做質控或體內實驗時，需要考慮效率及沉淀比例問題，比如說做體內實驗時，是否能接近100%沉淀？這個是一個需要重點考慮的問題。占昌友老師介紹的抗體法對于脂質載體的沉淀率可以達到99%以上。魚精蛋白是否可以用于沉淀脂質載體，需要根據(jù)沉淀效率等實驗數(shù)據(jù)進行判斷。

3、如何解決PEG多次注射產生抗體的問題？

這個是非常好的問題，是疫苗臨床產生副作用的潛在原因之一。

解決思路有幾點，一個是將PEG的結構與臨床產生的免疫反應進行匹配（以進一步明確二者因果關系及作用機理），一個是拉長兩次注射的間隔，比如至少相隔3周以上。

需要明確的一點是，對PEG進行改造，即使可能會有所改善，但多多少少還是會對人體產生一定影響。

4、實驗室內LNP怎么儲存？

用于專門研究溫度穩(wěn)定性的LNP，會儲存于不同溫度條件下（從冷凍到室溫的溫度梯度）。

單純保存用于后續(xù)動物實驗等目的的LNP，儲存于-80℃或者-20℃冰箱。

5、單純研究脂質遞送系統(tǒng)載體性能，從成本考慮，可以推薦模型藥物嗎？

對于脂質體，推薦使用阿霉素作為模型藥物。

對于LNP，熒光蛋白或者Luc是比較常用的，方便檢測，前者適合細胞層面的檢測，如流式，缺點是活體成像容易受到熒光穿透性能限制，后者活體成像普遍，但是流式沒法檢測。最終還是要測定目標蛋白表達量，不同的mRNA體內性能一般也不一樣。此外，還可以利用DNA的barcode做篩選，這方面可以查文獻了解一下詳細的實驗方案。

6、mRNA拖尾影響翻譯效率，這個是加合作用造成的，原理是怎樣的？

加合作用指的是LNP中的可電離脂質發(fā)生氧化，產生醛基，醛基與mRNA堿基反應發(fā)生加合作用，表現(xiàn)為拖尾，該反應會影響mRNA分子的結構及穩(wěn)定性，進而影響其翻譯效率。（具體原理詳見艾偉拓公眾號近期推文，會進行詳細解釋。）

7、siRNA或mRNA的裝載策略可否多闡述一下？主動載藥的動力和包封率如何？

首先，核酸藥物的載藥不是通過傳統(tǒng)的脂質體主動載藥方式（如伊立替康脂質體使用蔗糖八硫酸酯鉀主動載藥或阿霉素脂質體使用硫酸銨主動載藥），核酸藥物通常是通過微流控體系內流體混合的方式來包封的，油相一般是乙醇溶解的各種脂質，水相是mRNA水溶液，二者通過微流控快速混合實現(xiàn)載藥。

包封效率方面，mRNA可以達到80%~90%，siRNA略低一些，核心問題在于儲存過程中siRNA由于其相對較小的分子量，泄漏的情況可能會比mRNA更嚴重一些。相比之下，siRNA藥物需要在提升包封率與降低儲存期滲漏率方面投入更多考量。

二、保護劑相關問題及答復：

1、脂質遞送產品中，糖是如何加入的？工藝是什么樣子的？

根據(jù)部分已上市脂質體及LNP藥物的工藝信息，糖類一般是作為透析液在置換外水相時加入的，通常發(fā)生在超濾步驟，部分液體劑型的脂質體，在載藥濃縮后也會使用含有糖類保護劑的溶液進行定容。

2、海藻糖加入多少量能夠得到較好的LNPs凍干產品？

一般而言，海藻糖的推薦用量低于蔗糖，而蔗糖在脂質體產品中，考慮對粒徑及PDI的控制，推薦用量為12%~20%左右，使用海藻糖可以從低于該范圍的用量開始嘗試，如5%~10%，具體用量需要根據(jù)制劑處方開發(fā)過程中實驗數(shù)據(jù)決定。

3、凍干工藝參數(shù)對脂質體的保護起的作用多大？還是只是保護劑種類更重要？另外，已上市的凍干劑型儲存條件是室溫么？還是必須還是要2-8度？

凍干工藝參數(shù)直接影響的是凍干過程和凍干效果，如一次干燥時間，最終凍干成品含水量等。如果凍干工藝參數(shù)設置不合理，一方面會降低凍干效率增加凍干成本，一方面會降低凍干成品質量。保護劑種類也是同理，選擇更適宜的凍干保護劑對于提升凍干效率及凍干成品質量均能夠發(fā)揮作用。二者在開發(fā)凍干劑型脂質體制劑中均需納入考量。

已上市凍干劑型脂質體藥物有室溫存儲的案例也有冷藏存儲的案例。

三、凍干工藝相關問題及答復：

1、請問凍干過程中，cake上升和塌陷的原因分別是什么？

蛋糕上升通常容易發(fā)生在溶質含量少的凍干樣品中，或者凍干機壓力波動太大，也容易導致蛋糕上升；講座中康老師提到的情況，是預凍沒凍住，出現(xiàn)的概率還是比較低的。

塌陷的原因是產品溫度超過了關鍵溫度。

2、怎么判斷脂質體凍干過程中預凍過程是成功的？

共晶點探頭插入樣品，電阻值達到最大，可以判斷為已經完成預凍。

3、在LNP-mRNA凍干過程中有什么特別要注意的？LNP-mRNA凍干與化藥脂質體干燥有什么異同？

由于LNP-mRNA的凍干項目目前做的還很少，所以還不能總結一個準確的異同點。目前的經驗是，預凍溫度需要更低，一次干燥階段壓力需要更低；

4、在小試凍干工藝開發(fā)成功后，再放大到中式凍干機以及大規(guī)模的過程中，哪些工藝參數(shù)需要改變，哪些工藝參數(shù)不需要改變？在放大的過程中需要注意什么？

一次干燥時間是一定要重新判斷的。如果研發(fā)階段工藝摸索的足夠充分的話，只需要改變一次干燥時間，不應該在放大的過程中，再重新摸索和調整板層溫度、腔體壓力，這兩個參數(shù)應該在研發(fā)過程中就已經充分研究。

5、如何監(jiān)測產品在凍干過程中的溫度變化？板層溫度和樣品的實際溫度是否是一致的？相差多少？

使用產品溫度探頭實時在凍干過程中檢測樣品溫度，建議選擇熱電偶探頭。

板層溫度和樣品溫度在預凍和二次干燥階段有一致的時間，一次干燥階段這兩個溫度都是不同的，溫差為升華熱量來源，至于兩個溫度差多少，不同產品，不同工藝，差的數(shù)值都不同。

6、在一次干燥中為什么要變化腔體壓力？整個過程中如何是極限真空會有什么影響呢？

一次干燥過程中，不需要變化腔體壓力。如果一次干燥階段一直是極限真空，則凍干時間會比較長，效率比較低，而且極限壓力很難控住，這樣的工藝穩(wěn)定性是不足的。

7、在LNP-mRNA凍干時，怎么判斷預凍是否成功？在一次干燥，也需要用熱電偶溫度探頭檢測其溫度嗎？還有凍干機自帶的溫度探頭一般放置西林瓶的什么位置，距離瓶底多少mm?

預凍是否成功，用共晶點探頭判斷，共晶點探頭插入樣品，電阻值達到最大，可以判斷為已經完成預凍。通常用戶用熱電偶溫度探頭檢測產品溫度，如果有升華界面溫度軟件會更準，但因為這個軟件比較貴，配了這個功能的用戶比較少。

溫度探頭頂部放在西林瓶靠近底部又沒有接觸底部的位置。

8、凍干時，溶液的體積占瓶子的體積最多多少？

一般來說，溶液體積通常不超過瓶子體積的一半。但也有客戶幾乎裝滿的，對于這個并沒有法規(guī)方面的規(guī)定，只不過裝的越高，工藝時間越長，塌陷的風險越高，工藝越難做。因此具體裝入多少溶液進行凍干，需要結合自身設備、工藝及制劑需求進行考量。