摘要：

當(dāng)前mRNA脂質(zhì)納米粒(LNP)疫苗的一個(gè)缺點(diǎn)是它們必須在（超）di溫下儲(chǔ)存，了解這些疫苗不穩(wěn)性的根本有助于我們合理提高mRNA-LNP產(chǎn)品的穩(wěn)定性，從而降低對(duì)儲(chǔ)存溫度的要求。在這篇綜述中，我們討論了mRNA-LNP可能的內(nèi)部結(jié)構(gòu)、影響mRNA-LNP穩(wěn)定性的因素以及優(yōu)化mRNA-LNP產(chǎn)品穩(wěn)定性的策略。對(duì)mRNA-LNP結(jié)構(gòu)的分析表明，mRNA、可電離的陽(yáng)離子脂質(zhì)和水存在于LNP中，中性輔助脂質(zhì)主要位于包裹的外壁。mRNA水解是mRNA-LNP不穩(wěn)定的主要因素。目前尚不清楚LNP中的水如何與mRNA相互作用，以及mRNA的易降解位點(diǎn)通過(guò)與可離子化的陽(yáng)離子脂質(zhì)的結(jié)合而受到多大程度地保護(hù)。為了提高mRNA-LNP疫苗的穩(wěn)定性，首先，應(yīng)優(yōu)化mRNA的核苷酸組成。其次，更好地了解mRNA在LNP中所處的環(huán)境可能有助于合理調(diào)整LNP結(jié)構(gòu)以保持mRNA的完整性。此外，干燥技術(shù)如凍干，可能是仍有待探索的可行途徑。

1、背景介紹

當(dāng)下正在開發(fā)的許多疫苗中，有兩款疫苗已在預(yù)防感中顯示出高效保護(hù)率，這兩款疫苗代著新一代疫苗產(chǎn)品：它們由脂質(zhì)納米粒包裹信使核糖核酸鏈（mRNA）。BioNTech/Pfizer和Moderna開發(fā)的這些mRNA疫苗的保護(hù)效力約為95%，并且是*獲得FDA“緊急使用授權(quán)"和EMA “條件批準(zhǔn)"的mRNA疫苗。疫苗mRNA編碼SARS-CoV-2病毒的刺突(S)糖蛋白，其中包括兩個(gè)脯氨酸替換（K986P和V987P突變），以穩(wěn)定糖蛋白的融合前構(gòu)象。在肌肉 (IM) 注射給藥后，LNP系統(tǒng)使宿主細(xì)胞能夠攝取并遞送mRNA 到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，其中mRNA序列在核糖體中翻譯成S蛋白。在宿主細(xì)胞進(jìn)行翻譯后加工后，S蛋白在細(xì)胞表面以其融合前構(gòu)象作為膜結(jié)合抗原被呈遞，為B細(xì)胞提供抗原靶標(biāo)。此外，部分翻譯表達(dá)的S蛋白進(jìn)入抗原呈遞途徑，通過(guò)T細(xì)胞表位的組織相容性復(fù)合體（MHC）呈遞提供T細(xì)胞的抗原識(shí)別。EMA評(píng)估報(bào)告將mRNA疫苗在注射部位的作用機(jī)制認(rèn)定如下：“注射LNP包裹的mRNA疫苗會(huì)導(dǎo)致短暫的局部炎癥，從而促使中性粒細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞(APC)募集到注射部位，招募的APC能夠攝取 LNP納米粒繼而表達(dá)S蛋白，隨后可以遷移到發(fā)生T細(xì)胞的局部淋巴結(jié)"，由于這種固有的先天免疫，沒有必要用額外的佐劑配制mRNA疫苗。有趣的是，輝瑞/BioNTech和Moderna專門使用修飾后的核糖核苷酸來(lái)構(gòu)建mRNA，以降低（而不是提高）mRNA固有的免疫原性，強(qiáng)調(diào)需要適當(dāng)平衡mRNA疫苗的先天免疫活性（下文詳細(xì)討論）。體內(nèi)抗原表達(dá)可以通過(guò)疫苗給藥后來(lái)實(shí)現(xiàn)，與mRNA疫苗的自佐劑特性相配合，終產(chǎn)生有效地中和抗體應(yīng)答和細(xì)胞免疫，從而為疫苗接受者降低感的風(fēng)險(xiǎn)。

與其他類型的疫苗相比，mRNA疫苗有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。mRNA疫苗的一個(gè)普遍優(yōu)勢(shì)是它們的開發(fā)相對(duì)較快，因?yàn)閙RNA-LNP是一種平臺(tái)技術(shù)。在鑒定保護(hù)性蛋白抗原并對(duì)相應(yīng)基因進(jìn)行測(cè)序后，可在數(shù)周內(nèi)制備mRNA。由于編碼不同抗原的mRNA在化學(xué)和物理上高度相似，新mRNA疫苗的配方設(shè)計(jì)和制造過(guò)程遵循相同的步驟。與有復(fù)制缺陷的病毒型載體相比，mRNA疫苗可能有更高的病毒保護(hù)效力。與基于病毒載體的疫苗不同，機(jī)體不會(huì)對(duì)載體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。在這方面，mRNA疫苗類似于基于脫氧核糖核酸(DNA)的疫苗。然而，DNA疫苗仍有小的機(jī)會(huì)進(jìn)行潛在的基因組整合。此外，與mRNA疫苗相比，DNA疫苗在早期臨床試驗(yàn)中顯示出相當(dāng)?shù)偷拿庖咴?，這可能是因?yàn)榛贒NA的疫苗需要進(jìn)入細(xì)胞核才能發(fā)揮作用，從而使有效遞送變得復(fù)雜?？傮w而言，靈活的設(shè)計(jì)、標(biāo)準(zhǔn)化的生產(chǎn)流程和相對(duì)較短的細(xì)胞質(zhì)存在時(shí)間使mRNA疫苗非常有優(yōu)勢(shì)，尤其是在病毒快速變異的大流行背景下。

然而，在開發(fā) mRNA疫苗時(shí)遇到的挑戰(zhàn)之一是它們的穩(wěn)定性差。目前，大多數(shù)mRNA疫苗是通過(guò)肌肉注射給藥的，在注射部位被宿主細(xì)胞攝取mRNA繼而表達(dá)出抗原。mRNA疫苗的早期研究表明，裸露的mRNA在給藥后會(huì)迅速降解。因此，在過(guò)去很多年，人們一直在努力改善體內(nèi)給藥后mRNA的穩(wěn)定性，一種方法是通過(guò)優(yōu)化mRNA結(jié)構(gòu)的方法來(lái)減緩其降解。另一種成功且目前廣使用的方法是用LNP將mRNA包封，從而保護(hù) LNP中的mRNA。這減少了給藥后mRNA過(guò)早的降解，并增強(qiáng)了向抗原呈遞細(xì)胞胞內(nèi)遞送的能力。

盡管目前在提高mRNA-LNP疫苗的體內(nèi)穩(wěn)定性和功效方面取得了進(jìn)展，但對(duì)其儲(chǔ)存過(guò)程中的穩(wěn)定性仍然關(guān)注較少。為了疫苗能有效地在全球范圍內(nèi)進(jìn)行流通，mRNA-LNP疫苗能夠在冷藏溫度（2-8°C）或更高的溫度下有足夠長(zhǎng)的有效期。目前，公開資料中幾乎沒有關(guān)于mRNA-LNP制劑長(zhǎng)期儲(chǔ)存穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。此外，尚不清楚在LNP中包封的mRNA會(huì)在多大程度上改善mRNA疫苗的儲(chǔ)存穩(wěn)定性。關(guān)于LNP包封mRNA的結(jié)構(gòu)和形態(tài)、LNP組分的化學(xué)穩(wěn)定性和mRNA-LNP系統(tǒng)的膠體穩(wěn)定性也知之甚少?，F(xiàn)在已知的是，為了更長(zhǎng)時(shí)間地儲(chǔ)存當(dāng)前的mRNA疫苗，它們必須被冷凍。目前Moderna和BioNTech/輝瑞的疫苗分別需要在-15~-25℃和-60~-90℃儲(chǔ)存，但迄今為止，這兩家公司mRNA疫苗產(chǎn)品的降解過(guò)程和儲(chǔ)存溫度要求不同的原因尚不*清楚。

將mRNA-LNP需要冷凍儲(chǔ)存阻礙了疫苗的流通。尤其是，需要儲(chǔ)存在-60~-90 °C的低溫，對(duì)疫苗在全球運(yùn)輸、儲(chǔ)存和流通是個(gè)大的挑戰(zhàn)。大多數(shù)其他疫苗可以在2–8 °C下儲(chǔ)存。顯然，當(dāng)前迫切需要研發(fā)出性質(zhì)更加穩(wěn)定不需要冷凍儲(chǔ)存的mRNA-LNP疫苗。本綜述概述了使mRNA疫苗更穩(wěn)定的方法，以便它們可以在不太的溫度下儲(chǔ)存更長(zhǎng)時(shí)間。為了探討該主題，討論了mRNA-LNP疫苗的特性及其對(duì)儲(chǔ)存穩(wěn)定性的影響，以確定mRNA疫苗不穩(wěn)定的原因并探索提高其穩(wěn)定性的方法。